USP
Universidade de São Paulo

SOLUÇÕES PARA O SEQUENCIAMENTO

 

Consulte o blog abaixo e tire suas dúvidas:

http://lifesequencing.blogspot.com.br/p/troubleshooting-sequenciamento.html

http://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-troubleshooting.html

 

Acesse:

 
 
 

Protocolo de Sequenciamento para DNA plasmidial ou produto de PCR usando Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems) 

 X  ul DNA (~100ng-200ng SEM CONTAR O VETOR) ou PRODUTO DE PCR

 3 ul primer (3,2pmoles/ul = 10pmoles/reação)

3 ul 5X sequencing buffer (se BigDye versão 3.0 ou anterior, usar save money)

2 ul BigDye v3.1

Completar  volume final com H20 para 15ul

Dar um pulso de 1000 rpm .

 

Programa Termociclador:

                       96oC  2 min

35 ciclos  de                96oC  45 seg

                                    50oC  30 seg (variável de acordo com o primer),

                                    60oC  4 min

 

                                   4oC infinito

 

Precipitação  da Reação de Sequenciamento usando glicogênio:

     1. Aos 15 ul da reação de sequenciamento adicionar 25 ul do mix** de precipitação.

     2. Vortexar e manter em gelo por 15 minutos ou freezer -20oC.

     3. Centrifugar 4.000 rpm por 20 minutos à temperatura ambiente.

     4. Inverter e descartar o excesso, dando a seguir um pulso de 1000 rpm com a placa invertida.

     5. Adicionar 50ul de etanol 70% gelado por reação e NÃO VORTEXAR.

     6. Repetir a centrifugação (10 min) e a drenagem dos tubos (passos 3 e 4).

     7. Secar por 1 hora em lugar protegido da luz, ou 1 minuto 96oC no termociclador aberto. 

 

    Se for enviar ao Serviço de Sequenciamento de DNA não adicionar nada, deixando as amostras seladas e envoltas com papel alumínio à -20oC. 

    Rotular a tampa e o corpo do tubo numericamente.

 

**Mix de precipitação para uma placa 96 wells: 2750ul de etanol 100% gelado; 110 ul de 3M NaOAc pH5,2; 110ul de  glicogênio 1mg/ml